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大鼠肝星狀細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗——胰酶消化法
發(fā)布時間: 2021-12-04 點擊次數(shù): 1614次材料與儀器
SD大鼠
戊巴(匕匕)妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液 D-Hanks' 液 酚紅 臺盼蘭 HBSS 氯化鈉 PBS
手術(shù)刀 手術(shù)剪 尼龍網(wǎng) 相差顯微鏡 熒光顯微鏡步驟
一、實驗材料準(zhǔn)備
1. 動物:雄性SD大鼠(體重250-450 g)。
2. 試劑:戊巴(匕匕)妥鈉,小牛血清(或胎牛血清,則更好),DMEM,酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配),18% Nycodenz(以GBSS配),D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L,KH2PO4 0.06 g/L,NaCl 8.0 g/L,NaHCO3 0.35 g/L,Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L,可加酚紅 0.02 g/L),HBSS,臺盼蘭等。
3. 器械:手術(shù)器械,200目尼龍網(wǎng),相差顯微鏡,熒光顯微鏡。
二、原代培養(yǎng)方法
1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹,進(jìn)行門靜脈插管,以D-Hanks'液灌注,同時剪開下腔靜脈,沖掉血液后,改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。
2. 待肝臟變軟后,離體肝臟并剪碎,繼續(xù)以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min,尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃,下同)。
3. 以HBSS重懸沉淀至10 ml,再混以20 ml Nycodenz液,分置于離心管中,并分別覆以2-3 ml HBSS,1450 g離心16 min后取界面細(xì)胞。
4. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞,以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),并判斷存活率和產(chǎn)量,最后按照常規(guī)方法接種(105細(xì)胞/cm2),次日換液,以后每2-3天換液一次。
三、傳代方法
棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次,加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化,鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右),以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA,可以不需離心),充分吹打后以1:2-1:3接種,然后繼續(xù)培養(yǎng)(5%CO2,37℃)。
四、 結(jié)果接種次日,光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀,胞質(zhì)內(nèi)有脂滴,熒光鏡下328 nm處見自發(fā)熒光。附上發(fā)表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1)。
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