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大鼠肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)——胰酶消化法
發(fā)布時(shí)間: 2021-12-04 點(diǎn)擊次數(shù): 1082次材料與儀器
Wistar乳鼠
PBS 牛血清 青霉素 鏈霉素 EDTA 胰酶 碘酒 酒精
綿球 科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿 塑料培養(yǎng)瓶步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 動(dòng)物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 試劑
PBS、培養(yǎng)液(Hyclone的低糖DMEM,含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青鏈霉素、1%明膠PBS、0.25%胰酶(含EDTA,GIBCO),碘酒和酒精綿球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科彎剪2把、眼科直鑷2把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套,25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar)。
二、具體操作
1. 明膠包被培養(yǎng)瓶過(guò)夜(準(zhǔn)備2-3個(gè)),取出明膠,用2 ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍,置于超凈臺(tái)中。
2. 解剖取肺:將乳鼠在酒精中浸泡后取出,轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)上的玻璃培養(yǎng)皿中,用碘酒消毒胸部皮膚,再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部,右手以眼科直剪剪開(kāi)皮膚,充分撕拉開(kāi),再用酒精棉球消毒,繼而以另一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開(kāi)肋骨,然后在切口中間橫剪胸骨。用眼科鑷取出肺,置于盛有PBS(含有200 U/ml青鏈霉素)的玻璃平皿中,沖洗去血。
3. 用眼科剪將肺分成幾個(gè)肺葉,用鑷子去除周邊的血凝塊及纖維組織,用眼科剪剪去肺門處的支氣管和血管,再用含有雙抗的PBS沖洗1遍。
4. 用眼科彎剪將肺組織剪碎成1 mm3大小,加入含有雙抗的PBS,將肺組織塊吹打開(kāi),靜置15 min后,更換新的PBS。
5. 用200 ul微量加樣器(最好是超凈臺(tái)中專用的,臨用時(shí)用酒精綿球好好擦拭槍柄)取200 ul加樣槍頭一個(gè),剪去尖,在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中,每瓶20-25塊左右,每小塊間距0.5 cm左右。組織塊放置好后,輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn),讓瓶底朝上,向瓶?jī)?nèi)加入2 ml左右的培養(yǎng)液,蓋好瓶蓋,將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置在溫箱中,干貼壁2-4 h后,將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放,繼續(xù)靜置培養(yǎng)。注意上述操作過(guò)程中動(dòng)作要輕柔,讓液體慢慢覆蓋組織小塊,嚴(yán)禁動(dòng)作過(guò)快致使液體產(chǎn)生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗。48 h后換液,更換2-3 ml即可。
6. 貼塊貼壁72 h后,鏡下可見(jiàn)大量的成纖維細(xì)胞爬出,將組織塊去除,繼續(xù)培養(yǎng)2-3天,待細(xì)胞長(zhǎng)滿,即可傳代。注:因?yàn)檠鍧舛鹊停瑑?nèi)皮細(xì)胞可以爬出少量,但是很快就會(huì)死掉。
2.7 傳代用0.25%胰酶常規(guī)消化,以1:2傳代,傳代完后,采用差速貼壁法純化一次,即待細(xì)胞貼壁1.0 -1.5 h后(即絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞都已經(jīng)貼壁),棄去未貼壁的細(xì)胞和培養(yǎng)液,更換新的培養(yǎng)液。成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形形態(tài),常呈漩渦狀生長(zhǎng)。
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