大鼠肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)——胰酶消化法

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.  動(dòng)物

出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
 

2.  試劑
 

PBS、培養(yǎng)液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青鏈霉素、1%明膠PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精綿球。
 

3.   器械

眼科直剪2把、眼科彎剪2把、眼科直鑷2把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar)。

二、具體操作
 

1.   明膠包被培養(yǎng)瓶過(guò)夜(準(zhǔn)備2-3個(gè))，取出明膠，用2 ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍，置于超凈臺(tái)中。
 

2.  解剖取肺：將乳鼠在酒精中浸泡后取出，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)上的玻璃培養(yǎng)皿中，用碘酒消毒胸部皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪開(kāi)皮膚，充分撕拉開(kāi)，再用酒精棉球消毒，繼而以另一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開(kāi)肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。用眼科鑷取出肺，置于盛有PBS(含有200 U/ml青鏈霉素)的玻璃平皿中，沖洗去血。
 

3.   用眼科剪將肺分成幾個(gè)肺葉，用鑷子去除周邊的血凝塊及纖維組織，用眼科剪剪去肺門處的支氣管和血管，再用含有雙抗的PBS沖洗1遍。
 

4.  用眼科彎剪將肺組織剪碎成1 mm3大小，加入含有雙抗的PBS，將肺組織塊吹打開(kāi)，靜置15 min后，更換新的PBS。
 

5.  用200 ul微量加樣器(最好是超凈臺(tái)中專用的，臨用時(shí)用酒精綿球好好擦拭槍柄)取200 ul加樣槍頭一個(gè)，剪去尖，在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5 cm左右。組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)加入2 ml左右的培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置在溫箱中，干貼壁2-4 h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。注意上述操作過(guò)程中動(dòng)作要輕柔，讓液體慢慢覆蓋組織小塊，嚴(yán)禁動(dòng)作過(guò)快致使液體產(chǎn)生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗。48 h后換液，更換2-3 ml即可。
 

6.  貼塊貼壁72 h后，鏡下可見(jiàn)大量的成纖維細(xì)胞爬出，將組織塊去除，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，即可傳代。注：因?yàn)檠鍧舛鹊停瑑?nèi)皮細(xì)胞可以爬出少量，但是很快就會(huì)死掉。
 

2.7 傳代用0.25%胰酶常規(guī)消化，以1:2傳代，傳代完后，采用差速貼壁法純化一次，即待細(xì)胞貼壁1.0 -1.5 h后(即絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞都已經(jīng)貼壁)，棄去未貼壁的細(xì)胞和培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。

成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形形態(tài)，常呈漩渦狀生長(zhǎng)。