CRISPR-Cas9系統(tǒng)：慢病毒轉(zhuǎn)染

CRISPR慢病毒轉(zhuǎn)染法是一種高效引入CRISPR基因編輯系統(tǒng)到目標(biāo)細(xì)胞中的技術(shù)，旨在實現(xiàn)對基因的有針對性編輯或調(diào)控。

實驗步驟：

1.質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建好含有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒，其中包括lentiCRISPR-sgRNA。該質(zhì)粒攜帶

sgRNA序列，可指導(dǎo)Cas9蛋白準(zhǔn)確識別并切割目標(biāo)。

2.慢病毒包裝質(zhì)粒：準(zhǔn)備慢病毒包裝質(zhì)粒，其中包括pCMV-VSV-G（攜帶包膜蛋白）和pCMV-dR8.2 dvpr（攜帶包裝蛋白）。這兩者協(xié)同作用，使得慢病毒能夠高效地傳遞CRISPR-Cas9系統(tǒng)到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：使用適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞，通常選擇293T細(xì)胞，以確保細(xì)胞處于最佳的生長狀態(tài)。

4.轉(zhuǎn)染試劑準(zhǔn)備：在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為適用于陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基。同時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑，包括Lipofectamine 3000、助轉(zhuǎn)劑P3000以及含有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒。

5.轉(zhuǎn)染操作：將質(zhì)?；旌衔锱c轉(zhuǎn)染試劑按照試劑盒的推薦比例進(jìn)行混合，隨后滴加到目標(biāo)細(xì)胞上，此過程中，確?；旌衔锱c細(xì)胞充分接觸，有利于轉(zhuǎn)染效率的提高。

6.培養(yǎng)條件：將細(xì)胞置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一定的時間，通常在48小時內(nèi)。

7.收獲：收集細(xì)胞上清液，通過離心去除細(xì)胞殘渣。

8.濾膜過濾：使用0.22 μm孔徑的聚醚砜濾膜過濾細(xì)胞上清液，以去除殘留的細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。

9.慢病毒收獲：得到的慢病毒上清液即為經(jīng)過純化和感染活性驗證的慢病毒，可用于后續(xù)實驗中對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行感染（若病毒感染效率低，可使用試劑盒進(jìn)行濃縮病毒）。

10.慢病毒感染：將目的細(xì)胞接種于 6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行慢病毒感染，感染后48H，加入適量濃度的篩選藥物puromycin（具體濃度通過藥物篩選實驗獲得），24h后換液去除死細(xì)胞，繼續(xù)傳代維持培養(yǎng)。

11.單克隆篩選：

①流式細(xì)胞術(shù)篩選：此法存在一些不足之處，其中包括重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式篩選的過程。因為這種操作可能導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)歷多次振蕩，增加了細(xì)胞的脆弱性，細(xì)胞的生存狀況可能會受到不良影響，所以不太建議采用這種方式。

②無限稀釋法，將96個細(xì)胞稀釋至10ml培養(yǎng)基中，然后將其種植到96孔板中，確保每個孔內(nèi)只有一個細(xì)胞。完成種植后，建議在觀察過程中每次僅觀察十個孔，因為長時間的外部觀察可能導(dǎo)致細(xì)胞受到應(yīng)激損傷，影響后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)，甚至?xí)?dǎo)致部分細(xì)胞死亡。進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)時，首先將細(xì)胞鋪在96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞長至80%的融合后進(jìn)行消化。隨后，將細(xì)胞傳到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中，以確保單克隆的純化。并非所有細(xì)胞都能成功生長，因此在考慮實際情況時，一般需要大約一兩個月的時間才能獲得理想的實驗結(jié)果。

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