PCR 操作中必知的 6 大細(xì)節(jié)

1、最好使用一次性進(jìn)口 tip 頭，以避免液體殘留；同時(shí)，tip 頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

2、加樣時(shí)，tip 頭要伸入 PCR 反應(yīng)管的液面下一點(diǎn)，然后將液體緩緩打入液面下，至恰好打出一個(gè)小氣泡為至；加樣過程最好在冰塊上操作；移液槍用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性，而導(dǎo)致加樣量的不準(zhǔn)確。

3、配制反應(yīng)體系時(shí)，若反應(yīng)物為凍結(jié)制品，需在融解后上下顛倒輕輕均勻混合；加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長(zhǎng)了濃度不均；按照液體體積由大到小的順序?qū)⒎磻?yīng)物加入到 PCR 管中；引物和模板和體系所加的比例要合適，模板過量反而會(huì)抑制體系的反應(yīng)。

4、 操作多份樣品時(shí)，可先制備反應(yīng)混合液，即將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好后分裝，這樣即可避免污染，又可增加反應(yīng)的精確度。

5、避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況,開蓋前稍離心；PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為 48h 以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚至消失。

6、如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

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