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    細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的正確操作方法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-02  點(diǎn)擊次數(shù): 4007次

    細(xì)胞凍存與復(fù)蘇,是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常見工作。



    細(xì)胞凍存,是指將細(xì)胞貯存在超低溫環(huán)境中,使細(xì)胞暫時(shí)“冬眠"的技術(shù),在需要的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇。


    細(xì)胞復(fù)蘇,是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細(xì)胞快速解凍,并使細(xì)胞重新恢復(fù)生長(zhǎng)的技術(shù)。


    本文將為大家介紹細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)要點(diǎn)和操作步驟。 


    細(xì)胞凍存篇


    凍存原則


    凍存原則為“慢凍",即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。


    如果直接將細(xì)胞懸液放在超低溫下快速冷凍,細(xì)胞會(huì)受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護(hù)劑(如DMSO、甘油)和在凍存盒中添加的異丙醇,都起到程序性降溫的作用。


    DMSO使用注意事項(xiàng)


    DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中,延緩溫度下降速度,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。


    需注意的是,DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí),將釋放大量熱量,所以凍存液需提前配制,不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中,避免燙傷細(xì)胞。


    另外,DMSO屬于致癌物質(zhì),使用時(shí)應(yīng)戴好手套,規(guī)范操作。


    程序凍存液配方


    程序凍存液成分一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%,DMSO比例為5%~10%。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),推薦凍存液配比:55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%胎牛血清+5%DMSO,難養(yǎng)細(xì)胞可用90%胎牛血清+10%DMSO凍存。


    細(xì)胞凍存密度


    細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中,不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞,所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升復(fù)蘇存活率,推薦密度為100~300萬(wàn)細(xì)胞/mL。


    凍存操作方法


    方法一:使用程序凍存盒 



    使用程序降溫盒是較為常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇,有些則不需要。


    降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用。


    根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),使用程序凍存盒凍存效果良好,沒有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三。


    操作步驟

    步驟1:配制程序凍存液,放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷

    步驟2:離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞消化下來離心,懸浮細(xì)胞直接離心,轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,時(shí)間3min)

    步驟3:用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標(biāo)記

    步驟4:凍存管放入凍存盒,凍存盒放入-80℃冰箱過夜(24h)

    步驟5:凍存管從凍存盒取出,轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存


    圖片

     ▲ 使用凍存盒操作示意圖


    方法二:使用無血清非程序凍存液 



    無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液,無需自己配制,無需降溫盒,大大提升了便捷性。


    但是,并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液,使用前必須做凍存測(cè)試,沒問題后再批量應(yīng)用。


    操作步驟

    步驟1:從冰箱拿出無血清非程序凍存液,待用

    步驟2:離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞消化下來離心,懸浮細(xì)胞直接離心,轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,時(shí)間3min)

    步驟3:棄上清,加入適量無血清非程序凍存液,重懸細(xì)胞

    步驟4:按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標(biāo)記

    步驟5:將凍存管直接移入-80℃冰箱中,24h后轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存


    圖片

    ▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖


    方法三:手動(dòng)梯度降溫 



    在沒有凍存盒或者非程序凍存液時(shí),可以選擇手動(dòng)梯度降溫。但手動(dòng)梯度降溫不適用于所有細(xì)胞,且效果不穩(wěn)定,同樣需要先做凍存測(cè)試。


    操作步驟

    步驟1:配制程序凍存液,放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷

    步驟2:離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞消化下來離心,懸浮細(xì)胞直接離心,轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,時(shí)間3min)

    步驟3:用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標(biāo)記

    步驟4:凍存管按照【4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(24h)→液氮】的順序放置


    圖片

    ▲ 手動(dòng)梯度降溫操作示意圖


    細(xì)胞復(fù)蘇篇


    復(fù)蘇講究“快融",越快融化,細(xì)胞所受損傷就越小。細(xì)胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜,但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打,才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率。


    復(fù)蘇步驟


    步驟1:水浴鍋預(yù)熱至37℃?zhèn)溆?/strong>


    步驟2:準(zhǔn)備15mL離心管,并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

    小貼士:離心管中加入2~9mL的培養(yǎng)基,比較難養(yǎng)的細(xì)胞,可適量增加培養(yǎng)基。


    步驟3:將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出,放入PE手套中,迅速投入水浴鍋

    小貼士:如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠(yuǎn)(步行超過1min),要把細(xì)胞先置于干冰上,再送至水浴鍋。如果將細(xì)胞凍存管直接放在手上或口袋里,可能導(dǎo)致溫度逐漸回升而產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞。而將細(xì)胞凍存管裝在PE手套中,是為了預(yù)防污染。


    步驟4:用力搖晃凍存管,使其在1分鐘內(nèi)融化

    小貼士:這一步越快融化越好,最好能放計(jì)時(shí)器在旁邊。如果1分鐘內(nèi)沒有融化,可能是凍存液量偏多,或者搖晃力度不夠。


    步驟5:用紙巾擦拭水漬,轉(zhuǎn)移至生物安全柜。用移液槍吸取細(xì)胞懸液,緩慢滴加到步驟2中準(zhǔn)備好的離心管


    小貼士:當(dāng)同時(shí)復(fù)蘇多管細(xì)胞時(shí),注意不要弄混。


    步驟6:1200rpm離心3分鐘

    小貼士:離心是為了去除DMSO,對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞,必須離心;若復(fù)蘇的細(xì)胞對(duì)DMSO不敏感,步驟6、步驟7可以省略,直接將培養(yǎng)基補(bǔ)足至10mL,接種至培養(yǎng)器皿中,第二天換液。


    步驟7:棄上清,用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中


    圖片

    ▲ 細(xì)胞復(fù)蘇操作示意圖


    做完步驟7,細(xì)胞就復(fù)蘇好了。復(fù)蘇的細(xì)胞需要一段時(shí)間恢復(fù)狀態(tài),當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞密度低于80%時(shí),48小時(shí)內(nèi)不要換液,待細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度等恢復(fù)正常,再進(jìn)行傳代等操作。(不要因?yàn)閺?fù)蘇后兩三天細(xì)胞狀態(tài)不好就丟棄,應(yīng)耐心等待至少一周。)


    當(dāng)然,復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)很好的情況下,可以提前開始實(shí)驗(yàn)。



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